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上海晶抗生物干貨分享流式細胞處理
更新時間:2023-10-16   點擊次數:177次

流式細胞檢測實驗中,除了血液樣本,幾乎所有的樣本均為實體組織,如脾臟、肝臟、腎臟、脂肪、腫瘤等,那么為了做好流式的檢測,我們首先得將實體組織消化成為活性較佳的單細胞懸液。

那么怎樣得到活性較佳的單細胞懸液呢?今天小晶為大家帶來客戶咨詢多的實體組織的單細胞懸液提取,以小鼠脾臟、小鼠腫瘤組織的提取為例,感興趣的話就跟小晶一起往下學習吧。

一、小鼠脾臟單細胞懸液制備

脾臟是體內大的免疫器官,含有大量的淋巴細胞和巨噬細胞,是機體細胞免疫和體液免疫的中心,負責機體的造血、紅細胞清除和免疫功能。一般免疫研究者很難逃過對脾臟的研究,如調節性T細胞、輔助性T細胞、巨噬細胞等的熱門研究,均有脾臟的身影,那么怎么獲得活性非常好的脾臟單個細胞呢?

詳情步驟:

① 獲取新鮮的小鼠脾臟,小鼠的脾臟呈橢圓形狀,可以直接用鑷子拉扯分離。將小鼠脾臟放入預冷的有適量 HBSS緩沖液的培養皿或大小適中的離心管中,并使用手術剪或眼科剪,小心將脾臟剪碎。

② 將細胞篩網放在50 mL 離心管上方,使用一次性移液器,將剪碎后的脾臟轉移到細胞篩網輕輕的搗碎或碾壓,使其通過篩網。必要時,加入5–10 mL PBS 沖洗。重復上述步驟,可使用1 mL注射器進行驗證,若通過篩網的細胞懸液使用注射器(帶針頭)進行反復吹打,則可認為單細胞懸液制備完成。

③ 將流式細胞懸液在4°C下,以400-600 g 或1500 rpm 離心細胞10 min,棄上清,用2–5 mL 預冷的1x PBS 重懸細胞。將重懸液置于冰上備用,必要時可以對細胞進行臺盼藍染色初步判斷活率,也可對細胞進行單細胞計數,調整至合適的細胞濃度后根據檢測實驗目的分別進行染色、上機檢測。

二、小鼠腫瘤組織單細胞懸液制備

小鼠腫瘤發病特征和人類腫瘤很相似,因此對人類腫瘤的研究有很高的價值,而對應的小鼠腫瘤動物模型的類型及其建立方法,對腫瘤研究起到至關重要的作用。進一步,如何更好地利用實驗材料驗證實驗結論,關鍵在于對腫瘤組織的檢測方法。其中流式檢測腫瘤組織的免疫功能就成了超級熱點,那么怎么才能得到活性較好的、干擾較少的腫瘤組織單細胞懸液用于流式檢測呢?跟小晶一起學習一下吧!

詳情步驟:

① 沿腫瘤組織輕輕剪開,盡可能完整的剝離整個腫瘤,將剝離好的腫瘤放入預冷的有適量 HBSS緩沖液的培養皿或大小適中的離心管中,盡量冰上放置保持細胞良好活性。

② 并使用手術剪或眼科剪,小幅度、高頻的方式將腫瘤塊剪碎,大約剪成<1mm2大?。ㄈ庋劭闯誓酀{狀),整個過程建議在冰上操作,使用適量的 PBS 進行洗滌,1500 rpm 離心10 min,沉淀的組織樣本待消化。

③ 每樣本加入2-3 mL 配置好的消化液(可根據腫瘤大小調整1×消化液的用量),用1 mL 槍頭將腫瘤組織碎末打散,置于37 °C 恒溫搖床,300 rpm 搖晃,使酶與組織充分接觸,約消化30 min 左右,期間每15 min 取出吹打一次,可取一滴觀察細胞分離情況,從而適當調整消化分離時間,消化時間不宜過長,以免影響免疫細胞活性。

④ 消化完畢后,加入3 mL(組織量過多可成倍加入含5%血清的 DMEM 終止消化。用巴氏吸管吸取消化后的腫瘤組織懸液至70 μm 細胞濾網過濾,同時用1 mL 注射器后部研磨遺留在濾網上的組織塊,所得懸液4 °C,50 g 離心10 min,收集上清,則為腫瘤細胞懸液。

⑤ 根據所購買的淋巴流式細胞分離液,對腫瘤懸液進行 PBMC 的提取,提取出中間白膜層后根據檢測的實驗目的分別進行染色、上機檢測。


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